Исследование бактерий имеет большое практическое значение для человека. На сегодняшний день открыто большое количество прокариот, которые отличаются друг от друга по патогенности, области распространения, форме, размерам, количеству жгутиков и другим параметрам. Чтобы детально изучить данный штамм, применяется бактериологический метод исследования.

Какие существуют методы клеток?

Чтобы определить, являются ли бактерии патогенными, проводят исследование культуры различными способами. Среди них:

1. Бактериоскопический метод.

2. Бактериологический метод.

3. Биологический метод.

Бактериоскопический и бактериологический основаны непосредственно на работе с клетками прокариот, когда биологический анализ требуется для изучения влияния таких клеток на живой организм подопытных животных. По степени проявления тех или иных признаков заболевания ученый может сделать вывод о наличии или отсутствии патогенных бактерий в пробе, а также естественно их размножить в организме животного для получения их культуры и использования в других работах.

Бактериологический метод исследования отличается от бактериоскопического. В первом для анализа используется специально подготовленная культура живых прокариот, когда во втором проводится работа с мертвыми или живыми клетками на предметном стекле.

Этапы бактериологического метода исследования. Микробиология

Принцип изучения свойств бактериальной культуры может пригодиться как для ученых-микробиологов, которые поставили цель исследовать прокариотические клетки, так и для лаборантов, задача которых заключается в установлении патогенности или непатогенности бактерий, а затем диагноза пациента.

Методика изучения бактерий делится на три этапа:

1. Выделение бактерий из первоначальной пробы.

2. Высевание бактерий и выращивание изучение ее свойств.

Первый этап

Проба, или мазок, берется со свободной поверхности среды или у пациента. Таким образом мы получаем «коктейль» из множества видов бактерий, которые должны высеять на питательную среду. Иногда появляется возможность выделить сразу необходимые бактерии, зная их очаги распространения в организме.

Через двое-трое суток отбираются нужные колонии и высеваются на твердые среды чашек Петри с помочью стерильной петли. Во множестве лабораторий работают с пробирками, где может находиться твердая или жидкая питательная среда. Так и проводится бактериологический метод исследования в микробиологии.

Второй этап

После получения отдельных колоний бактерий проводится непосредственный макро- и микроанализ. Измеряются все параметры колоний, определяется цвет и форма каждой из них. Нередко проводится подсчет колоний на чашке Петри, а затем в исходном материале. Это имеет значение при анализе патогенных бактерий, от числа которых зависит степень заболевания.

Бактериологический метод исследования, 2 этап которого заключается в изучении отдельных колоний микроорганизмов, может быть сопряжен с биологическим способом анализа бактерий. Еще одна цель работы на этом этапе - увеличить количество исходного материала. Это можно сделать на питательной среде, а можно провести эксперимент в естественных условиях на живых подопытных организмах. Патогенные бактерии будут размножаться, и в результате кровь будет содержать миллионы клеток прокариот. Из взятой крови легко приготовить необходимый рабочий материал бактерий.

Третий этап

Самая важная часть исследования - это определение морфологических, биохимических, токсигенных и антигенных свойств культуры бактерий. Работа ведется с заранее «очищенными» культурами на питательной среде, а также с препаратами (зачастую окрашенными) под микроскопом.

Установить принадлежность патогенных или условно-патогенных бактерий к той или иной систематической группе, а также определить их устойчивость к лекарствам позволяет бактериологический метод исследования. 3 этап - антибиотики, т. е. анализ поведения клеток бактерий в условиях содержания лекарственных препаратов в окружающей среде.

Исследование устойчивости культуры к антибиотику имеет важное практическое значение, когда необходимо прописать для конкретного пациента необходимые, а главное, действенные препараты. Здесь и может помочь бактериологический метод исследования.

Что такое питательная среда?

Для развития и размножения бактерии должны находиться в заранее подготовленных питательных средах. По консистенции они могут быть жидкие или твердые, а по происхождению - растительные или животные.

Основные требования к питательным средам:

1. Стерильность.

2. Максимальная прозрачность.

3. Оптимальные показатели кислотности, активности воды и других биологических величин.

Получение изолированных колоний

1. Метод Дригальского. Он заключается в том, что на бактериальную петлю наносится мазок с различными видами микроорганизмов. Этой петлей проводят по первой чашке Петри с питательной средой. Далее, не меняя петлю, методом остаточного материала проводят по второй и третьей чашкам Петри. Так, на последних образцах колонии бактерии будут засеваться не слишком плотно, тем самым упрощается возможность найти необходимые для работы бактерии.

2. Метод Коха. В нем используются пробирки с расплавленной питательной средой. Туда помещается петля или пипетка с мазком бактерий, после чего содержимое пробирки выливается на специальную пластинку. Агар (или желатин) застывает через какое-то время, а в его толще легко обнаружить нужные колонии клеток. Важно перед началом работы развести смесь бактерий в пробирках, чтобы концентрация микроорганизмов не была очень большой.

Этапы которого основаны на выделении нужной культуры бактерий, не обходится без этих двух способов нахождения изолированных колоний.

Антибиотикограмма

Визуально реакцию бактерий на препараты можно заметить двумя практическими способами:

1. Метод бумажных дисков.

2. Разведение бактерий и антибиотика в жидкостной среде.

Метод бумажных дисков требует наличия культуры микроорганизмов, которые были выращены на твердой питательной среде. На такую среду кладут несколько бумажек округлой формы, пропитанных антибиотиками. Если препарат успешно справляется с нейтрализацией бактериальных клеток, после такой обработки останется участок, лишенный колоний. Если же реакция на антибиотик отрицательная, бактерии выживут.

В случае использования жидкой питательной среды сперва готовят несколько пробирок с культурой бактерий разных степеней разведения. В эти пробирки добавляют антибиотики, и в течение суток наблюдают за процессом взаимодействия вещества и микроорганизмов. В конечном итоге получается качественная антибиотикограмма, по которой можно судить об эффективности препарата для данной культуры.

Основные задачи анализа

Здесь перечислены по пунктам цели и этапы бактериологического метода исследования.

1. Получить исходный материал, который будет использоваться для выделения колоний бактерий. Это может быть мазок с поверхности любого предмета, слизистой оболочки или полости органа человека, анализ крови.

2. на твердой питательной среде. Через 24-48 часов на чашке Петри можно обнаружить колонии бактерий разных видов. Отбираем по морфологическим и/или биохимическим критериям нужную и проводим уже с ней дальнейшую работу.

3. Размножение полученной культуры. Бактериологический метод исследования может опираться на механический или биологический способ увеличения численности культуры бактерии. В первом случае ведется работа с твердыми или жидкими питательными средами, на которых в термостате размножаются бактерии и образуют новые колонии. Биологический способ требует естественных условий увеличения численности бактерий, поэтому здесь микроорганизмами заражается подопытное животное. Через несколько суток в пробе крови или мазке можно обнаружить множество прокариот.

4. Работа с очищенной культурой. Чтобы определить систематическое положение бактерий, а также их принадлежность к возбудителям заболеваний, необходимо провести тщательный анализ клеток по морфологическим и биохимическим признакам. При исследовании патогенных групп микроорганизмов важно знать, насколько эффективно действие антибиотиков.

Это была общая характеристика бактериологического метода исследования.

Особенности проведения анализа

Главное правило проведения бактериологического исследования - это максимальная стерильность. Если идет работа с пробирками, посевы и пересевы бактерий должны проводиться только над нагретой спиртовкой.

Все этапы бактериологического метода исследования требуют использования специальной петли или пастеровской пипетки. Оба инструмента должны быть предварительно обработаны в пламени спиртовки. Что касается пастеровской пипетки, то тут перед термической стерилизацией необходимо отломать кончик пипетки пинцетом.

Техника посева бактерий тоже имеет свои особенности. Во-первых, при посеве на твердые среды проводят бактериальной петлей по поверхности агара. Петля, конечно же, уже должна иметь на поверхности образец микроорганизмов. Также практикуется посев внутрь и в этом случае петля или пипетка должны достичь дна чашки Петри.

При работе с жидкими средами используются пробирки. Здесь важно следить, чтобы жидкости не касались краев лабораторной посуды или пробки, а используемые инструменты (пипетка, петля) не дотрагивались до посторонних предметов и поверхностей.

Значение биологического метода исследования

Анализ пробы бактерий имеет свое практическое применение. Прежде всего бактериологический метод исследования может использоваться в медицине. К примеру, необходимо изучить микрофлору больного, чтобы установить правильный диагноз, а также выработать правильный ход лечения. Здесь помогает антибиотикограмма, которая покажет активность лекарственных препаратов против возбудителя заболеваний.

Анализ бактерий используется в лаборатории для определения таких опасных заболеваний, как туберкулез, возвратный тиф или гонорея. Также он применяется для изучения бактериального состава миндалин, полостей органов.

Бактериологический метод исследования можно использовать для определения загрязненности среды. По данным о количественном и качественном составе мазка с поверхности какого-либо предмета определяется степень заселенности данной среды микроорганизмами.

Возможности использования бактериологического исследования при глазных заболеваниях ограничены пределами доступности патологического очага. При расположении его в заднем отрезке глаза получить материал для исследования часто очень Трудно и возможность бактериологической диагностики в таких случаях, естественно, исключается. Основная область применения бактериологической диагностики в глазной практике — это заболевания наружного отдела глаза, а также проникающие ранения, при которых материал для исследования может быть получен во время хирургической обработки раны или при извлечении инородного тела. Вообще надо заметить, что при оперативных вмешательствах круг возможностей для получения бактериологического материала значительно расширяется.

Получение материала для исследования

Для получения материала из конъюнктивального мешка пользуются платиновой петлей (при ее отсутствии можно использовать петлю, изготовленную из нити спирали электроплитки, или другой инструмент (стеклянная палочка, шпатель и т. п.), которую предварительно стерилизуют прокаливанием в пламени спиртовой горелки. Оттянув нижнее веко, остывшей петлей захватывают комочек конъюнктивального отделяемого из глубины нижнего свода. При этом необходимо избегать прикосновения петли к коже и краям век, чтобы не занести в материал постороннюю микрофлору. Брать материал желательно до начала лечения и в утренние часы, когда отделяемое бывает более обильным. При отсутствии слизи и гноя (например, при исследовании здоровой конъюнктивы перед операциями) следует использовать слезную жидкость или слегка поскоблить поверхность соединительной оболочки (по Линднеру). Но лучше в таких случаях применить методику Элыннига: впустить в конъюнктивальный мешок из пастеровской пипетки одну каплю стерильного физиологического раствора или бульона и через несколько секунд отсосать эту каплю.

По тем же общим правилам получают материал из слезного мешка, выдавливая его содержимое, и с края века при язвенном блефарите, сняв предварительно корочку с язвы.

Большая осторожность требуется при взятии материала с роговой оболочки, особенно при наличии ползучей язвы роговицы. Петлю (или другой тупой инструмент) следует направлять косо к поверхности язвы и брать материал из прогрессирующего края ее. При этом необходима анестезия (3 капли 1% дикаина) и фиксация глазного яблока.

В качестве материала для исследования при проникающих ранениях глаза можно использовать отделяемое раны (если оно имеется), захватив его петлей или марлевым тампоном, пунктат передней камеры или извлеченное инородное тело, которое помещают в стерильную пробирку с 1-2 мл физиологического раствора. После встряхивания пробирки раствор используют для исследования.

Из передней камеры материал для исследования может быть получен с режущего инструмента во время парацентеза или посредством пункции. После анестезии роговицы (3 капли 1% раствора дикаина) и фиксации глазного яблока косо у лимба вкалывают иглу шприца, вводят ее в переднюю камеру (осторожно, не ранить радужную оболочку и капсулу хрусталика!) и отсасывают 0,3 мл содержимого передней камеры.

При эндофтальмите может возникнуть потребность в получении материала из стекловидного тела. Пункция глазного яблока проводится после анестезии (1 мл 2% раствора новокаина под конъюнктиву) острой и с достаточно широким просветом иглой, вкалываемой ближе к экватору. Отсасывается 0,3-0,5 мл внутриглазного содержимого.

Полученный материал подвергается изучению с целью выявления микроба и определения его вида (микробиологический диагноз). Материал может изучаться:

1. на предметном стекле (бактериоскопический метод);
2. в посевах (собственно бактериологический метод);
3. в эксперименте на животном (биологический метод).

Бактериоскопический метод

может быть использован в условиях любого глазного стационара при наличии несложного лабораторного оборудования и некоторых реактивов.

Для этого необходимо иметь следующее:

1. металлическую петлю;
2. чистые предметные стекла (на чистом стекле капля воды расплывается, а не принимает шаровидную форму);
3. ванночку с подставками для предметных стекол (стеклянные палочки или толстая медная проволока);
4. дистиллированную воду;
5. спирт;
6. пинцет;
7. фильтровальную бумагу;
8. раствор Люголя (йода 1 г, йодистого калия 2 г, дистиллированной воды 300 мл);
9. растворы красок (лучше в склянках, закрытых пипетками с резиновыми баллончиками).

Для очистки новые стекла кипятят в 1% растворе соды (можно использовать золу), а затем промывают водой, слабой соляной кислотой и вновь водой. Стекла, бывшие в употреблении, помещают на 1-2 часа в серную кислоту, после чего кипятят в растворе соды, промывают водой и опускают в 96° спирт. Хранят стекла либо в спирте, либо, вытерев спирт, сухими, в банках с притертой пробкой.

Наиболее употребительные краски: карболовый фуксин Циля (фуксина основного 1 г, кристаллической карболовой кислоты 5 г, спирта 96° 10 мл, глицерина — несколько капель, дистиллированной воды 100 мл). Для окраски фуксин Циля обычно разводят дистиллированной водой в 10 раз (разведенный, или водный фуксин). Метиленовая синька (метиленовой синьки 10 г, спирта 96° 100 мл). Из нее готовят щелочную синьку Леффлера (спиртового раствора синьки 30 мл, 1% калийной или натриевой щелочи 1 мл, дистиллированной воды 100 мл). Карболовый генцианвиолет (готовится так же, как карболовый фуксин Циля).

Микробов изучают либо в живом виде (способы «раздавленной» и «висячей» капли), либо убитыми (в окрашенном препарате). Исследование в живом виде в основном выявляет способность микробов к активному движению, тогда как окрашенные препараты позволяют хорошо изучить их морфологию.

Различают простые способы окраски, когда обычно употребляется одна краска, и сложные способы окраски, выявляющие некоторые особенности физико-химического строения микробной клетки и имеющие поэтому дифференциально-диагностическое значение.

Техника приготовления окрашенных препаратов сводится к следующему. Материал наносят на чистое предметное стекло и равномерно распределяют по поверхности в виде кружка или овала. Мазок должен быть достаточно тонким. При наличии густого гноя следует предварительно нанести на предметное стекло одну каплю дистиллированной воды и размешать материал в этой капле. Мазок высушивают на воздухе. Стекло с высушенным препаратом берут за края большим и указательным пальцами мазком кверху и фиксируют троекратным проведением через пламя спиртовой горелки (на границе светлой и темной его части). При достаточной фиксации ощущается легкое жжение в пальцах. Зафиксированный мазок окрашивают. Готовят несколько препаратов, по меньшей мере два, один из которых окрашивают простым способом (метиленовая синька Леффлера, разведенный фуксин Циля), другой — по способу Грама.

Окрашивание по Леффлеру:

1. на мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор синьки Леффлера на 3-5 минут;
2. препарат промывают дистиллированной водой и высушивают.

Окрашивание по Граму:

1. на мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, на который наливают раствор генцианвиолета на 1-2 минуты;
2. сливают краску, снимают бумажку и, не промывая водой, наливают яа препарат люголевский раствор на 1 минуту; при этом мазок чернеет;
3. сливают люголевский раствор и обесцвечивают мазок спиртом (лучше путем погружения препарата в стаканчик со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек);
4. тщательно промывают водой;
5. заливают мазок разведенным фуксином на 1-2 минуты;
6. сливают краску, промывают препарат водой и высушивают.

Удобный способ Грама в модификации Синева, который предложил пользоваться заранее приготовленными кусочками фильтровальной бумаги, пропитанной раствором генцианвиолета и высушенной. На мазок предварительно наносят 2-3 капли воды и затем кладут эти кусочки бумаги. Дальше поступают, как описано выше.

Микроскопию мазков производят с иммерсионным объективом. При окраске по Леффлеру все микробы окрашиваются в синий цвет; при окраске по Граму — либо в сине-фиолетовый (грамположительные микробы), либо в красный цвет (грамотрицательные микробы).

Ограниченное число микробов, участвующих в заболеваниях наружного отдела глаза, и их характерные морфологические признаки нередко позволяют поставить правильный микробиологический диагноз уже с помощью одного только бактериоскопического исследования.

Бактериологический метод

становится необходимым в тех случаях, когда изучение в мазках оказывается недостаточным для установления вида микроба или возникает потребность в определении чувствительности выделенного возбудителя к антибактериальным препаратам.

Отсылая за подробным ознакомлением с бактериологическим методом к специальным руководствам по микробиологии, остановимся здесь лишь на принципах этого метода. Первый этап работы сводится к выделению отдельных видов микробов, т. е. к получению чистых культур. Для этого прибегают к механическому разобщению материала при посеве и к использованию сред, наиболее пригодных для развития предполагаемых возбудителей (элективные среды). Путем пересева отдельных колоний, выросших на среде, получают чистую культуру, которую исследуют под микроскопом (готовят мазки) и пересевают на дифференциально-диагностические среды для изучения биохимических свойств возбудителя.

Высокая требовательность большинства патогенных для глаза микробов в условиях культивирования обусловила преимущественное применение для их выделения элективных сред, содержащих нативный белок. Таковы, например, среда Эльшнига (одна часть лошадиной сыворотки или асцитической жидкости и две части бульона), свернутая сыворотка Леффлера (три части сыворотки и одна часть бульона с 1% пептона, 0,5% NaCl и 1% виноградного сахара), кровяной агар Левенталя (агар и 5-10% дефибринированной крови).

Что касается определения чувствительности микробов к антибиотикам, то наиболее простой способ такого определения заключается в использовании специально изготовляемых промышленностью дисков из фильтровальной бумаги, пропитанных растворами антибиотиков и высушенных в вакууме. Материал для исследования (гной, пунктат, извлеченное инородное тело) помещают в стерильную пробирку с физиологическим раствором (1,5-2 мл). После встряхивания жидкость выливают в чашки Петри, лучше в две — одну с сахарным, другую с кровяным агаром — и покачиванием равномерно распределяют по поверхности среды. Затем на поверхность агара накладывают диски с различными антибиотиками на расстоянии 2 см друг от друга и от края чашек. Чашки ставят в термостат (37°) и на следующий день по величине зоны задержки роста вокруг дисков судят о степени чувствительности микроба к испытуемым антибиотикам. Отсутствие зоны задержки роста указывает на нечувствительность микроба к данному антибиотику.

Биологический метод

в глазной практике применяется только в тех случаях, когда при затрудненной диагностике токсигенное свойство может оказаться решающим в определении вида микроба (например, при дифференциальной диагностике дифтерийной палочки и палочки ксероза).

Лабораторная диагностика вирусных заболеваний глаза

В настоящее время специальное изучение вирусов, в том числе вируса трахомы (рис. 77), осуществляется с помощью культивирования их в культурах тканей (куриный эмбрион, асцит-карцинома мышей и др.) и электронной микроскопии.

Рис. 77. Клеточные включения при трахоме.

В клинической практике для диагностики трахомы применяется метод цитологического изучения соскоба конъюнктивы на наличие или отсутствие телец (включений) Провачека—Гальберштедтера. Для этого тупым скальпелем или краем предметного стекла соскабливают эпителиальный покров конъюнктивы (без крови), который наносят тонким слоем на предметное стекло, в течение 5 минут подсушивают на воздухе и фиксируют путем опускания на 15-20 минут в стаканчик с метиловым спиртом или смесью Никифорова (этиловый эфир и абсолютный спирт в равном количестве). Окраску производят в течение 3-4 часов свежеприготовленным раствором краски Романовского—Гимза (из расчета одна капля краски на 1 мл дистиллированной воды). Затем препарат промывают текучей водой, подсушивают на воздухе и исследуют под микроскопом. При этом ядра эпителиальных клеток оказываются окрашенными в розовый цвет, протоплазма — в светло-синий, включения — в синий, сине-фиолетовый цвет (рис. 77). Последние представляются в виде кокковидных образований, расположенных среди мелкозернистой массы, и признаются носителями трахоматозного вируса. Они чаще обнаруживаются в свежих случаях нелеченой трахомы, но могут встречаться и при паратрахомных конъюнктивитах.

Исследования последних лет выявили новую форму контагиозного вирусного заболевания глаз — эпидемический кератоконъюнктивит, а цитологическое изучение конъюнктивального соскоба при этом заболевании позволило обнаружить в эпителиальных клетках своеобразные включения, совершенно отличные от телец Прсвачека (Б. Л. Поляк, Н. В. Плошинская).

Суть метода – выделение чистой культуры микроба – возбудителя из патологического материала, подробное изучение его морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, серологических свойств с целью последующей идентификации возбудителя. При осуществлении бактериологического метода исследования выделяют 4 этапа.

А. Учитывая данные, полученные при бактериоскопическом исследовании, осуществляется выбор максимально эффективных питательных сред, на которых с наибольшей долей вероятности удастся получить рост культуры предполагаемых микробов – возбудителей.

Б. Производится посев исследуемого материала на ряд питательных сред: жидких и плотных, универсальных, элективно-селективных, дифференциально-диагностических. При этом посев на чашки Петри с плотными питательными средами производится бактериологической петлей штрихом с целью обеспечить возможность получения роста изолированных друг от друга колоний микробов (можно пользоваться также способом Дригальского или другим методом разобщения культур микроорганизмов).

А. Изучаются культуральные свойства выросших на питательных средах микроорганизмов; производится отбор подозрительных колоний. Следует подчеркнуть, что отбор подозрительных колоний – самый ответственный и трудный этап работы. Он основан, прежде всего, на определении характерных особенностей колоний микробов, но зачастую это не позволяет дифференцировать колонии микробов отдельных видов и приходится дополнительно изучать морфологию микробов в мазках из подозрительных колоний, особенности роста микроорганизмов на дифференциально-диагностических средах и т.д. Выделение чистых культур бактерий и их изучение можно осуществлять, проводя предварительный посев на жидкие среды накопления, но при этом затрачивается дополнительное время исследования.

Б. Из подозрительных колоний готовится бактериологический мазок, окрашивается по Граму и микроскопируется (устанавливается идентичность микроорганизмов с изученными при микроскопическом исследовании на 1-ом этапе).

В. Из оставшейся части подозрительной колонии производится пересев культуры на скошенный мясо-пептонный агар (можно использовать и другие питательные среды, на которых предполагается хороший рост выделенных микроорганизмов). Цель, накопления чистой культуры микроба – предполагаемого возбудителя заболевания, т.к. на следующем этапе исследования потребуется много микробной массы.

У предполагаемого возбудителя изучаются сахаролитические свойства (производится посев на среды пестрого ряда среды Олькеницкого, Ресселя и др.), протеолитическая активность (посев на желатин, молоко по Тукаеву, определение образования индола и сероводорода при росте на мясо-пептонном бульоне). Исследуется чувствительность выделенных культур к антибиотикам (чаще методом стандартных бумажных дисков, реже – методом серийных разведений). Производится серотипирование в реакции агглютинации на стекле с групповыми и типовыми диагностическими сыворотками; фаготипирование со стандартными диагностическими бактериофагами. Для идентификации в некоторых случаях изучаются факторы патогенности у бактерий.

Производится учет результатов проведенных исследований. На основании сопоставления выявленных у микроорганизмов свойств (морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, серологических и т.д.) осуществляется идентификация микробов. Выдается окончательный ответ с результатами бактериологического исследования, где указывается вид возбудителя (иногда – его серотип, биовар, фаготип) и его чувствительность к антибиотикам.

Довольно часто для получения достоверных результатов выдаче ответа предшествуют, биологический, аллергологический или другие методы исследования.

Достоинства бактериологического метода диагностики : высокая достоверность результатов исследования; возможность получения дополнительных данных о чувствительности выделенных возбудителей к антибиотикам; возможность проведения эпидемиологических исследований.

Культуральный (бактериологический) метод исследования - совокупность способов, направленных на выделение и идентификацию чистых культур микроорганизмов (бактерий) с помощью культивирования на питательных средах.

Чистая культура - совокупность микроорганизмов одного вида. Чаще всего чистую культуру получают путем отбора и культивирования изолированной колонии (потомство одной микробной клетки).

Этапы метода:

1. Забор материала для исследования.

2. Выделение чистой культуры и ее идентификация.

3. Заключение.

Забор материала для исследования. Вид исследуемого материала зависит от цели исследования (диагностика - от больного; эпиданализ - из внешней среды, продуктов питания, больного и (или) бактерионосителя).

Выделение чистой культуры . Включает 3 или 4 этапа:

1. Посев материала (после предварительной микроскопии) на чашку с плотной питательной средой (лучше дифференциально-диагностической или селективной) с целью получения изолированных колоний. Производят его чаще всего методом механического разобщения. В некоторых случаях (например, кровь) материал предварительно засевают в жидкую среду обогащения с последующим пересевом на чашку с агаровой средой. Иногда до посева проводят селективную обработку материала (с учетом свойств выделяемого микроорганизма; например, обработка кислотой или щелочью для выделения устойчивых бактерий). Культивируют при температуре 37°С в течение 18-24 часов. Время культивирования для разных видов бактерий может колебаться.

2(3):а) изучение колоний на чашке с агаром (культуральные признаки), отбор наиболее типичных; б) приготовление мазков из этих колоний с окраской (по Граму или другими методами); а) отсев остатка исследованной колонии на среду накопления и выращивание в термостате при оптимальной температуре.

3(4). Изучение чистоты культуры, полученной на среде накопления. С этой

целью готовят мазок, окрашивают (чаще по Граму), микроскопически изучают

морфологическую и тинкториальную однородность (в разных полях зрения).

4(5). Идентификация чистой культуры.

Заключение. По совокупности признаков в сравнении со свойствами эталонных (типовых) штаммов указывается вид выделенного из материала микроорганизма.

Оценка метода:

достоинства: относительно высокая чувствительность и точность, возможность определить численность микробов в исследуемом материале, а также чувствительность к антибиотикам;недостатки: относительная длительность, метод дорогостоящий.

21. Питательные среды для аэробов и анаэробов. Требования, предъявляемые к питательным сре­дам, классификация.

Требования:

среды должны быть питательными

должны иметь определенные ph

должны быть изотоническими, т.е. осмотическое давление в среде должго быть такое же как в клетке.

должны быть влажными и не слишком жидкими

должны облпдпть определенным окислительно-восстановительным потенциалом

должны быть стерильными

должны быть унифицированными, т.е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов.

Питательные среды можно разделить:

А) По происхождению:

1} естественные - натуральные продукты питания (мясо, молоко, картофель);

2) искусственные - приготовленные специально для выращивания микробов: - среды из естественных продуктов (мясная вода, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), - не имеющие постоянного состава; - синтетические питательные среды - растворы строго определенных количеств солей, аминокислот, азотистых оснований, витаминов в дистиллированной воде - имеют постоянный состав, используются для выращивания микроорганизмов и культур клеток при получении вакцин, иммунных сывороток и антибиотиков;

Б) По назначению:

1) общего назначения (МПБ, МПА) - на них растет большинство микробов;

2) элективные - избирательно способствуют росту одного вида микробов из смеси (например, желточно-солевой агар для стафилококков);

3) дифференциально-диагностические - позволяют отдифференцировать по внешнему виду среды один вид микроба от других (например среды Эндо, Левина для кишечной группы микробов).

Кроме того, в зависимости от целей использования в схеме выделения чистых культур, по назначению можно выделить следующие среды:

1) обогащения - подавляют рост микробов, сопутствующих возбудителю;

2) для получения изолированных колоний;

3) накопления чистой культуры;

В) По консистенции:

1) жидкие;

2) полужидкие (при добавлении агар-агара в концентрации 0,5-0,7%);

3) плотные - выше 1%.

Культуральныйметод исследования представляет собой выделение из питательной средыбактерий определённого вида путём культивирования,с их последующей видовой идентификацией. Вид бактерий определяется с учётом их строения, культуральных и экологических данных, а также генетических, биохимических и биологических показателей. Для проведения бактериологической диагностики используются схемы, которые утверждены Минздравом.

Выведенные из питательной среды новые виды бактерий, свойства которых ещё не определены, называются чистой культурой . После окончательной идентификации их характеристик, бактерии,выведенные из определённого места и в определённое время, получают название штамм. При этом допускается незначительное различие в свойствах, месте или времени выделения штамма одного вида.

Цель метода :

1. Этиологический диагноз, то есть выделение и идентификация чистой культуры бактерий.

2. Определение количества микроорганизмов и их особых характеристик. Например, специфическая реакция на антибиотики.

3. Выявление внутриродовых отличий микроорганизмов, на основе их эпидемиологической и генетической составляющей. Это необходимо для определения общности микроорганизмов выделенных в разных местах и разных условиях, что важно для эпидемиологических целей.

Данный метод исследования имеет определённый ряд этапов, различных для аэробных, факультативных и облигатных аэробных бактерий.

Выведение чистой культуры для аэробных и факультативных аэробных бактерий.

1 этап

А) Подготовительные мероприятия . Эта стадия включает в себя забор, хранение итранспортировку материала. Также, при необходимости, может проводиться его обработка, в зависимости отсвойств изучаемых бактерий. Например, при обследовании материала на туберкулёз, для выявления кислоустойчивых микробактерий используются растворы щёлочи или кислоты.

Б) Обогащение . Данная стадия не является обязательной и проводится в том случае, если количества бактерий в исследуемом материале недостаточно для проведения полноценного исследования. Например, при выделении гемокультуры, исследуемую кровь помещают в среду в соотношении 1 к 10 и хранят в течение суток при температуре 37 о.

В) Микроскопия . Мазок исследуемого материала окрашивается и изучается под микроскопом - исследуется микрофлора, её свойства и количество. В дальнейшем из первичного мазка необходимо отдельно выделить все находящиеся в нём микроорганизмы.

Г) Создание отдельных колоний . На чашку, со специальной, селективной средой, наносится материал, для этого используют петлю или шпатель. Далее, устанавливают чашку вверх дном, для защиты колоний от конденсата, и хранят в термостате около 20 часов, поддерживая температуру 37 о.

Важно! Следует помнить, что в процессе исследования, необходимо придерживаться правил изоляции. С одой стороны, для защиты исследуемого материала и выводимых бактерий, и с другой стороны, для предотвращения заражения окружающих лиц и внешней среды.

Что касается условно-патогенных микроорганизмов, то при их выведении, имеет значение их количественная характеристика. В этом случае, проводится количественный посев, при котором проводят несколько стократных разведений материала в изотоническом растворе хлорида натрия. После, осуществляют посев в чашки Петри по 50 мкл.

2 этап

А) Изучение морфологических свойств колоний в средах и их микроскопия . Исследуются чашки и отмечаются свойства микроорганизмов, показатели их количества, темпы роста, а также отмечается наиболее подходящая питательная среда. Для изучения лучше всего выбрать колонии, располагающиеся ближе к центру, и если образуется несколько типов чистых культур, то изучить каждую в отдельности.Для изучения морфотипной чистоты культуры используют мазок колонии, его окрашивают (обычно используется метод по Граму или же любой другой) и тщательно микроскопируют.

Б) Накопление чистой культуры . Для этого колонии всех морфотипов рассаживают в отдельные пробирки с питательной средой и содержат в термостате при определённой температуре(для большинства микроорганизмов подходящей является температура 37 о, но в некоторых случаях может быть иной).

Питательной средой для накопления часто служит среда Клиглера.Она имеет «скошенный» вид в пробирках, где 2/3 её части в виде столбика, а 1/3 – скошенная поверхность, окрашена в светло-красный цвет. Состав:

· МПА

· 0,1% глюкозы

· 1% лактозы

· Специальный реактив на сероводород

· Феноловыйкрасный индикатор.

3 этап

А) Уровень роста и чистоты культуры . В общем порядке, выведенная чистая культура имеет однородный рост и при микроскопическом рассмотрении клетки имеют одинаковое морфологическое и тинкториальное строение. Но встречаются некоторые виды бактерий с ярковыраженным плеофоризмом, при этом, встречаются клетки, имеющие различное морфологическое строение.

Если в качестве питательной среды использовалась среда Клиглера, то по изменению цвета столбика и скошенной части определяются биохимические характеристики. Например, если происходит разложение лактозы - желтеет скошенная часть, если глюкозы - пожелтение столбика; при продукции сероводорода происходит почернение из-за перехода сульфата в сульфид железа.

Как можно заметить на рисунке, среда Клиглера имеет свойство изменять свой цвет. Это происходит из-за того, что расщепление бактериями азотистых веществ и образование продуктов щёлочи происходит неоднородно как в столбике (анаэробные условия), так и на скошенной поверхности (аэробные условия).

В аэробной среде (скошенная поверхность) наблюдается более активное образование щёлочи, чем в анаэробной среде (столбик). Поэтому, когда происходит разложение глюкозы, кислота на скошенной поверхности без труда нейтрализуется. Но, при разложении лактозы, концентрация которой намного больше, кислоту не выходит нейтрализовать.

Что касается анаэробной среды, то щелочных продуктов генерируется крайне мало, поэтому здесь можно наблюдать, как глюкоза ферментируется.

Рис. Питательная среда Клиглера:

1 – исходная среда,

2 – рост E. coli,

3 – рост S. paratyphi B,

4 – рост S. Typhi.

E . coli – способствует разложению глюкозы и лактозы с образованием газов, не производит водород. Вызывает пожелтение всей среды с разрывами.

S. paratyphi – способствует разложению глюкозы с образованием газов, лактозоотрицателен. Скошенная часть цвет не изменяет, столбик – желтеет.
S. paratyphi A- не продуцирует сероводород.
S. paratyphi B – сероводород продуцируется (по ходу укола проявляется чёрный цвет).

S. typhi – глюкоза разлагается без газообразования, сероводород продуцируется, лактозоотритателен. Скошенная часть не изменяет цвета, столбик – желтеет и среда чернеет по ходу укола.

Shigella spp.- лактозоотрицателен, глюкозоположителен, сероводород не продуцируется. Столбик приобретает жёлтый оттенок, а скошенная часть остаётся прежней.

Б) Финальная идентификация чистой культуры и её реакция на антибиотики . На данном этапе изучаются биохимические, биологические, серологические и генетические свойства культуры.

В исследовательской практике не возникает необходимости в изучении полного спектра свойств микроорганизмов. Достаточно использовать простейшие тестирования для определения принадлежности микроорганизмов к тому или иному виду.