Цитохром Р450 (CYP450) — большая группа ферментов, отвечающая за метаболизм чужеродных органических соединений и лекарственных препаратов. Ферменты семейства цитохрома Р450 осуществляют окислительную биотрансформацию лекарственных препаратов и ряда других эндогенных биоорганических веществ и, таким образом, выполняющих дезинтоксикационную функцию. С участием цитохромов происходит метаболизм многих классов лекарственных средств, таких как , антигистаминные препараты, ингибиторы ретровирусной протеазы, бензодиазепины, блокаторы кальциевых каналов и другие.

Цитохром Р450 представляет комплекс белка с ковалентно связанным гемом (металлопротеином), обеспечивающим присоединение кислорода. Гем, в свою очередь, является комплексом протопорфирина IX и двувалентного атома железа. Число 450 обозначает, что восстановленный гем, связанный с СО, отличается максимумом поглощения света при длине волны 450 нм.

Цитохромы Р-450 участвуют не только в метаболизме лекарств, но и в превращении гемоглобина в билирубин, синтезе стероидов и др. Все изоформы цитохрома Р-450 объединены в семейства CYP1, CYP2, CYP3. Внутри семейств выделены подсемейства A, B, C, D, E. В пределах подсемейств изоформы обозначены порядковым номером. Например, CYP2C19 — наименование 19-го по порядку цитохрома подсемейства «С», семейства «2». Всего существует около 250 различных видов цитохрома Р-450, из них примерно 50 — в организме человека и только шесть из них (CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4) имеют отношение к метаболизму лекарств.

На активность цитохромов Р-450 оказывает влияние множество факторов — курение, алкоголь, возраст, генетика, питание, болезни. Эти факторы отвечают за формирование индивидуальных особенностей работы ферментов Р-450 и определяют эффекты лекарственного взаимодействия у конкретного пациента.

Важность цитохромов Р450 для гастроэнтерологии

Значительно возросший в последнее время интерес гастроэнтерологов к изоформам цитохрома Р450 CYP2C19 и CYP3A4 обусловлен в их ролью в метаболизме производных бензимидазола, к которым относятся все лекарственные препараты из группы по A02BC «Ингибиторы протонового насоса» ( , и ). Клинически существенно, что ген CYP2C19 отличается полиморфностью и от состояния этого гена у пациента в значительной степени зависит величина терапевтического эффекта различных ИПП.

Среди ИПП наибольшее ингибирующее действие в отношении CYP2C19 проявляет лансопразол, в меньшей степени омепразол и эзомепразол. Еще ниже эффект рабепразола, однако значительное ингибирующее воздействие на активность CYP2C19 оказывает его тиоэфир, образующийся в ходе неферментного метаболизма. Наименьшее влияние на CYP2C19 оказывает пантопразол. Наибольшее ингибирующее воздействие на CYP3A4 in vitro у пантопразола, далее (по мере уменьшения эффекта) омепразол, эзомепразол и рабепразол и лансопразол. Для пациентов, получающих несколько лекарственных препаратов, из ИПП предпочтительнее пантопразол ().

При активном участии CYP3A4 происходит метаболизм , и большого числа других лекарств.

Целый ряд гастроэнтерологических препаратов ингибируют цитохром CYP3A4, оказывая тем самым влияние на фармакокинетику принимаемых совместно лекарств.

Проблема взаимодействия лекарств

В современной клинической практике широко распространено комбинированное применение лекарств, что связано с наличием у пациента нескольких заболеваний или недостаточной эффективностью монотерапии. При комбинированной терапии возможно взаимодействие лекарств. Более одного лекарства принимает примерно 56 % пациентов в возрасте до 65 лет и 73 % пациентов старше 65 лет. Прием двух лекарств приводит к их взаимодействию у 6 % пациентов. Назначение 5 (или 10) лекарств повышает частоту взаимодействий до 50 (или 100) %.

Потенциально опасные комбинации лекарств являются серьезной клинической проблемой. Имеются данные, что от 17 до 23 % назначаемых врачами комбинаций лекарств являются потенциально опасными. Только в США из-за непредусмотренного взаимодействия лекарств умирает 48 тысяч больных в год. сняло с регистрации несколько лекарств (в том числе ) по причине их потенциально опасных взаимодействий с другими лекарствами, приводивших, в том числе и к летальным исходам.

Основные механизмы взаимодействий лекарств связаны с изменением их фармакокинетики или фармакодинамики. Наиболее существенными, согласно современным представлениям, являются изменения фармакокинетики при метаболизме лекарств с участием цитохромов Р-450.

Примером опасного взаимодействия является недавно обнаруженное взаимодействие ИПП и , широко применяемого при лечении больных ишемической болезнью сердца. Для уменьшения риска гастроинтестинальных осложнений больным, получающим ацетилсалициловую кислоту в комбинации с клопидогрелом, назначают ИПП. Поскольку биоактивация клопидогрела происходит с участием CYP2C19, прием ИПП, метаболизируемых этим цитохромом, может снизить активацию и антиагрегантный эффект клопидогрела. В мае 2009 года на конференции Общества сердечно-сосудистой ангиографии и вмешательств (SCAI) были представлены данные, свидетельствующие, что одновременное использование клопидогрела и ИПП значительно повышает риск возникновения инфаркта миокарда, инсульта, нестабильной стенокардии, необходимости повторных коронарных вмешательств и коронарной смерти ().

Цитохром CYP2C19

Изоформа цитохрома Р450 CYP2C19 (S-мефенитоин гидроксилаза) катализирует реакции 5-гидроксилирования пиридинового кольца и 5"-деметилирования в бензимидазольном кольце. В человеческом организме CYP2C19 располагается в гепатоцитах.

Все типы мутаций гена CYP2C19 могут быть были разделены на три группы:

1. Без мутаций (гомозиготы), они же быстрые метаболайзеры ИПП.
2. Имеющие мутацию в одной аллели (гетерозиготы), промежуточный тип метаболизма.
3. Имеющие мутации в обеих аллелях, они же медленные метаболайзеры ИПП.

Распространенность генотипов CYP2C19, тип метаболизма и эффект ИПП при лечении кислотозависимых заболеваний даны в таблице:

Генотип CYP2C19	Распростра-ненность ( и др., 2006)			Тип метаболизма	Период полувыведения ИПП , T½, час ()	Кислото-ингибирующий эффект ИПП
		европеоидная раса	монголоидная раса
Без мутаций (гомозиготы)	90 % европеоидной популяции	50,6 %	34,0 %	Быстрый	1	Низкий
Мутация в 1-й аллеи (гетерозиготы)	10 % европеоидной популяции	40,5 %	47,6 %	Промежуточный	-	Средний
Мутация в обеих аллеях	20-30 % азиатской популяции	3,3 %	18,4 %	Медленный	2-10	Высокий

Медленные метаболизаторы от быстрых и промежуточных отличаются двукратно более высокими концентрацией ИПП в плазме крови и периодом полувыведения. Полиморфизм гена, кодирующего изоформу 2С19, определяет различную скорость метаболизма ИПП у пациентов. В связи с вышесказанным подбор ИПП рекомендуется проводить под контролем ().

• CYP2C19 активно метаболизирует следующие лекарства: трициклические антидепрессанты (амитриптилин, кломипрамин, имипрамин), антидепрессант — селективный ингибитор обратного захвата серотонина циталопрам, антидепрессант — ингибитор МАО моклобемид, антиконвульсионные и антиэпелиптические средства (диазепам, примидон, фенитоин, фенобарбитал, нордазепам), ингибиторы протонной помпы ( , и ), противомалярийное средство прогуанил, и индометацин, а также: варфарин, гликлазид, пропранолол, циклофосфамид, нелфинавир, прогестерон, тенипозид, тетрагидроканнабинол, каризопродол, вориконазол и другие
• сильные ингибиторы CYP2C19: моклобемид, флувоксамин, хлорамфеникол (левомицетин)
• неспецифические ингибиторы CYP2C19: ИПП омепразол и лансопразол, индометацин, а также , фелбамат, кетоконазол, модафинил, окскарбазепин, пробенецид, тиклопидин,
• индукторы CYP2C19: рифампицин, артемизинин, карбамазепин, норэтистерон, преднизон, зверобой.

Цитохром CYP3A4

Фермент CYP3A4 катализирует реакцию сульфоксидирования, приводящую к образованию сульфогруппы. CYP3A4 является одним из самых важных для фармацевтики цитохромов, так как им биотрансформируется, по крайней мере, частично, около 60 % окисляемых препаратов. Хотя активность CYP3А4 широко варьирует, он не подвержен генетическому полиморфизму. Расположение CYP3А4 на апикальных мембранах и гепатоцитах облегчает исполнение им метаболизм лекарств, предшествующий попаданию вещества в системный кровоток, что известно, как «эффект первого прохождения».

Генетический дефект CYP3A4 может быть причиной развития вторичного синдрома удлиненного интервала Q-T при приёме и, как следствие, развития сердечной артимии ().

• CYP3A4 является основным ферментом при метаболизме следующих лекарств: имуннодепрессанты (циклоспорин, сиролимус, такролимус), средства, применяемые при химиотерапии (анастрозол, циклофосфамид, доцетаксел, эрлотиниб, тирфостин, этопозид, ифосфамид, паклитаксел, тамоксифен, тенипозид, винбластин, виндезин, гефитиниб), противогрибковые средства (клотримазол, кетоконазол, итраконазол), макролиды ( , эритромицин), трициклические антидепрессанты (амитриптилин, кломипрамин, имипрамин), антидепрессанты — селективные ингибиторы обратного захвата серотонина (циталопрам, эсциталопрам, сертралин), антипсихотики (арипипразол, галоперидол, зипрасидон, рисперидон), опиоидные анальгетики (альфентанил, кодеин, метадон, фентанил), бензодиазепины (алпразолам, клоназепам, мидазолам, флунитразепам), гиполипидемические статины (аторвастатин, ловастатин, симвастатин), блокаторы кальциевых каналов (амлодипин, верапамил, дилтиазем,

Цитохромы Р 450 (КФ 1. 14. 1) – семейство гемсодержащих монооксигеназ, осуществляющих метаболизм ксенобиотиков, в том числе лекарственных препаратов. Локализованы в гладком эндоплазматическом ретикулуме клетки, открыты – Д. Гарфинкель, М. Клингенберг, 1958.

Цитохром Р 450 (англ. Cytochrome P 450, CYP) Название указывает на то, что он окрашен (Р – от английского Pigment). Цитохром Р 450, связанный с монооксидом углерода, имеет максимум поглощения света при длине волны 450 нм, что определило его название (Т. Омура и Р. Сато в 1964 г.). СО не имеет никакого отношения к функции Р 450. Он добавляется для того, чтобы облегчить определение содержания Р 450 по интенсивности спектра поглощения.

Использование термина «цитохром» применительно к гемопротеинам класса Р 450 нельзя считать удачным, так как функцией цитохромов является перенос электронов, а не катализ монооксигеназных реакций. Цитохром Р-450 относится к цитохромам типа b. Предшественник гема – протопорфирин IX.

Молекулярная масса различных цит. Р 450 колеблется 44 - 60 к. Да. Мономеры гемопротеина состоят из одной полипептидной цепи, содержащей от 45 до 55% неполярных аминокислотных остатков. Полная аминокислотная последовательность установлена для более чем 150 цит. Р 450. С помощью рентгеновской кристаллографии детально изучена трехмерная структура цит. Р 450 из P. putida. Белок содержит 414 аминокислотных остатков, М. м. - 47 к. Да, представляет собой асимметричную призму с основанием 3, 0 нм и сторонами по 5, 5 и 6, 0 нм.

Цит. Р 450 из P. putida содержит 4 антипараллельных спиральных участка, смесь спиралей и неупорядоченных структур, перемежающихся параллельными бета-структурами. Гем расположен между двумя параллельными спиралями. С пропионовыми группами гема взаимодействуют остатки Arg-112, Arg-229 и His-335. Другие аминокислоты, окружающие гем, неполярны. Гем не выходит на поверхность молекулы. Наименьшее расстояние от поверхности до гема составляет около 0, 8 нм.

Все мембранные цитохромы Р 450 на N-концевом фрагменте пептидной цепи имеют короткий гидрофобный участок, содержащий от 12 до 21 аминокислотных остатков. Он выполняет роль якорного пептида и содержит сигнальную последовательность, ответственную за встраивание белка в мембрану. За ним расположена стопсигнальная последовательность, останавливающая встраивание пептида в фосфолипидный бислой.

Цитохромы P 450 отсутствуют только у облигатно анаэробных организмов. Описано не менее 11 500 ? белков системы Цит. P 450 бактерий и архей растворены в цитоплазме. Переход к эукариотическим системам сопровождался встраиванием P 450 в мембрану. Все цит. P 450 высших организмов - мембранные ферменты. В эволюционном плане наиболее древней является бактериальная монооксигеназа.

Система цит. P 450 участвует в окислении многочисленных соединений, как эндогенных, так и экзогенных. Цит. Р 450 -зависимые монооксигеназы катализируют расщепление различных веществ с участием донора электронов и молекулярного кислорода. В этой реакции один атом кислорода присоединяется к субстрату, а второй восстанавливается до воды. Центр связывания кислорода – высокоспецифичен, центр связывания преобразуемого субстрата – относительно.

Ферменты семейства цитохрома P 450 разнообразны и различаются: по функциям, типами ферментативной активности, регуляторами активности (ингибитораи, индукторами). Отдельные изоформы (изоферменты) цит. Р-450 отличаются определенной специфичностью и каждая из них участвует в метаболизме относительно небольшого количества веществ.

Цитохром Р 450, наряду с монооксигеназной активностью, может проявлять оксидазную (А. И. Арчаков с сотр.), т. е. катализировать удаление водорода из субстрата, используя при этом в качестве акцептора водорода кислород и восстанавливать его до воды, или генерировать активные формы кислорода в виде супероксидного и гидроксильного радикалов, пероксида водорода. Р 450 обнаруживает пероксидазную активность, используя в реакциях окисления в качестве косубстратов вместо NADPH органические пероксиды или пероксид водорода. Имеются данные, что Р 450 может катализировать диоксигеназные реакции, вводить в окисляемое вещество два атома кислорода. Таким образом, характерной особенностью Р 450 является множественность функций, но основной является монооксигеназная.

Цит. P-450 кодируются суперсемейством генов. У человека в системе цит. Р-450 выявлено 57 генов и более 59 псевдогенов (нефункциональные аналоги структурных генов, утратившие способность кодировать белок и не экспрессирующиеся в клетке. Термин «псевдоген» был впервые предложен в 1977 году.). Nebert (1987) была разработана классификация цит. Р-450, основанная на дивергентной эволюции и гомологии последовательностей нуклеoтид/ аминокислотной. Суперсемейство подразделяется на 18 семейств и 43 подсемейства. Номенклатура генов цит. Р-450 человека описана подробно.

В настоящее время известны тысячи изоформ (изоферментов) цит. Р-450. Изоформы, имеющие более 40 % общего аминокислотного состава, объединены в семейства и обозначаются арабскими цифрами (CYP 1, CYP 2, CYP 3 и т. д.). Подсемейства обозначаются латинскими буквами и объединяют изоформы с идентичностью аминокислотного состава более 55 % (CYP 2 D, CYP 3 A и т. д.) В подсемействе отдельные изоформы обозначаются арабскими цифрами, следующими за латинскими буквами (CYP 1 A 2, CYP 2 D 6, CYP 3 A 4). Ксенобиотик может быть субстратом двух и более изоформы. Разные изоформы способны метаболизировать одно вещество в различных участках его молекулы

Цит. P 450 катализируют ω-окисление насыщенных жирных кислот (ж. к.), перекисное окисление ненасыщеных ж. к. , гидроксилирование стероидных гормонов, желчных кислот и холестерола, биосинтез простагландинов (локализованы в митохондриях, на ядерной мембране). Цитохромы P 450 микросом участвуют в метаболической биотрансформации ксенобиотиков (лекарств, ядов, наркотических веществ). В метаболизме ЛС принимают участие изоформы семейств I, II и III, из них основные - IA 1, 1 А 2, 2 А 6, 2 В 6, 2 D 6, 2 С 9, 2 С 19, 2 Е 1, ЗА 4.

Общие индукторы Ферменты Индуктор Фенобарбита Тяжелые металлы л Система цитохрома P 450 Индуктор Противоопухолевые лекарства Метилхолантрен Система цитохрома P 448 Эпоксидгидролазы Глутатион и УДФглюкуронилтрансферазы Синтез GSH Металлотионеины Р-гликопротеин Индуктор

Фенобарбитал активирует синтез цит. Р 450, УДФглюкуронилтрансферазы и эпоксид гидролазы. Например, у животных, которым вводили индуктор фенобарбитал, увеличивается площадь мембран ЭР, которая достигает 90 % всех мембранных структур клетки, и, как следствие, - увеличение количества ферментов, участвующих в обезвреживании ксенобиотиков или токсических веществ эндогенного происхождения. Одновременный прием фенобарбитала и некоторых лекарственных препаратов, метаболизирующих при участии цит. Р 450, приводит к снижению эффективности последних за счет трансформации молекулы в процессе биотрансформации или быстрого их удаления из организма.

В настоящее время описано более 250 химических соединений, вызывающих индукцию микросомальных ферментов. Индукторы монооксигеназных систем разделяются на два класса. Представители первого класса (инсектициды, этанол и др.) вызывают выраженную пролиферацию гладкого эндоплазматического ретикулума в гепатоцитах и увеличение активности цитохрома Р 450. Стимуляция метаболизма, вызываемая индукторами второго класса (ПАУ - полициклические ароматические углеводороды: тетрахлордибензодиоксин, 3 -метилхолантрен, бенз(а)пирен и др. , не сопровождается пролиферацией гладкого эндоплазматического ретикулума, но при этом существенно возрастает активность многих ферментов биотрансформации. Усиление метаболизма большинства ксенобиотиков приводит к снижению токсичности. Вместе с тем токсичность некоторых ксенобиотиков под воздействием индукторов существенно возрастает. Например, усиливается токсичность четыреххлористого углерода, бромбензола, иприта и т. д.

Имеются химические вещества, способные ингибировать как ферменты 1 -й фазы биотрансформации (изоферменты цитохрома Р-450) и 2 -й фазы биотрансформации (N- ацетилтрансфераза и др.), так и транспортеры 3 -й фазы (РАТФазы). При снижении активности ферментов метаболизма возможно развитие побочных эффектов, связанных с длительной циркуляцией этих соединений в организме. Ингибирование транспортеров, как и их индукция, может приводить к различным изменениям (преимущественно к повышению) концентрации ксенобиотиков в плазме крови в зависимости от функций данного транспортера.

Элетронтранспортные цепи ЭПР 1 цепь включает: 1) цитохром P 450, имеет центры связывания для O 2 и гидрофобного субстрата; 2) NADPH-цитохром P 450 редуктазу, содержащую коферменты FAD и FMN; 3) NADPH+H+ – донор ē и Н+ в этой электрон-транспортной цепи; 4) O 2. 2 цепь включает: 1) цитохром P 450; 2) фермент NADH-цитохром b 5 редуктазу, коферментом которой является FAD; 3) цитохром b 5 – гемопротеин, переносящий ē от NADH-цитохром b 5 редуктазы на цитохром P 450; 4) NADH + Н+ – донор ē и Н+; 5) O 2. Цитохром P 450 один атом O 2 включает в молекулу субстрата, а 2 -й восстанавливает с образованием H 2 O за счет переноса ē и Н+ от NADPH+H+ при участии цитохром P 450 -редуктазы (или от NADH+H+ с помощью цитохром b 5 редуктазы и цитохрома b 5).

Еще одна схема организации электронтранспортной цепи ЭПР Источником электронов и протонов в цепи является НАДФН+Н+, который образуется в реакциях пентозофосфатного пути окисления глюкозы. Промежуточным акцептором Н+ и е- служит флавопротеин, содержащий кофермент ФАД (цитохром Р 450 -редуктаза). Конечное звено в цепи микросомального окисления - цитохром Р 450, восстанавливающий кислород до воды. Работа системы цит. Р-450 сопряжена с работой системы цит. b-5, источником электронов и протонов в которой является НАДН+Н+, образующийся в гликолизе. Промежуточным акцептором Н+ и е- служит флавопротеин, содержащий кофермент ФАД (цитохром b-5 -редуктаза).

Пример RH – субстрат цит. Р-450; стрелками показаны реакции переноса электронов. Восстановленную форму цит. -b 5 окисляет стеароил-Ко. А-монооксигеназа, которая переносит электроны на О₂. Один атом О₂ принимает 2 е¯ и переходит в форму О²¯. Донором электронов служит НАДФН, который окисляется НАДФН-цит. Р-450 редуктазой. О²¯ взаимодействует с протонами с образованием воы: О²¯ + 2 Н⁺ → Н₂О Второй актом кислорода включается в субстрат RH, образую гидроксильную группу вещества R-OH.

НАДФ-Н-цитохром Р-450 -редуктаза – флавопротеин. Один моль фермента содержит по одному молю флавинмононуклеотида (ФМН) и флавинадениндинуклеотида (ФАД). Поскольку цитохром С может служить акцептором электрона (используется в модельных системах), указанный фермент часто называют НАДФ-цитохром Средуктазой.

Механизм гидроксилирования субстрата при участии цитохрома Р-450 Условно можно выделить 5 этапов: 1. окисляемое вещество (S) образует комплекс с окисленной формой цитохрома Р-450; 2. происходит восстановление этого комплекса электроном от НАДФН; 3. восстановленный комплекс соединяется с молекулой O 2; 4. O 2 в составе комплекса присоединяет ещё один электрон с НАДФН; 5. комплекс распадается с образованием молекулы Н 2 О, окисленной формы цитохрома Р-450 и гидроксилированного субстрата (S-ОН).

В отличие от митохондриальной дыхательной цепи, в монооксигеназной цепи при переносе электронов не происходит аккумулирования энергии в виде АТФ. Микросомальное окисление является свободным окислением. В большинстве случаев гидроксилирование чужеродных веществ снижает их токсичность. Однако могут образоваться продукты с цитотоксическими, мутагенными и канцерогенными свойствами.

Цитохромы Р-450 являются мембранными белками и при исследовании их каталитической активности требуется сложное реконструирование монооксигеназной системы с использованием редокс-партнеров и фосфолипидов. Кроме того, изоферменты цит. Р-450 быстро инактивируются. Электрохимический метода анализа существенно упростил определение активности цит. Р-450. Первые работы, посвященные использованию электрода в качестве донора электронов для катализа цит. Р-450 (CYP 3 А 4): Кузнецов Б. А. , Местечкина Н. М. , Изотов М. В. , Карузина И. И. , Карякин А. В. , Арчаков А. И. (1979) Биохимия, 44, 1569 -1574. Арчаков А. И. , Кузнецов Б. А. , Изотов М. В. , Карузина И. И. (1981) Биофизика, 26, 352 -354.

В настоящее время разработаны электрохимические биосенсорные системы на основе иммобилизованных на электроде цитохромов Р-450. Электрокаталитическая реакция инициируется электронами с электрода. Это исключает необходимость использования редокс-партнеров монооксигеназной системы и восстановительных эквивалентов НАДФН. Определение каталитической активности иммобилизованного цит. Р-450 осуществляется с помощью регистрации каталитического тока, возникающего при внесении в электрохимическую систему субстрата. Регистрарация каталитического тока осуществляется методами вольтамперометрии или амперометрии и позволяет рассчитать многие характеристики ферментативного процесса: константу Михаэлиса-Ментен, электрохимическую каталитическую константу.

Зависимость изменения каталитического тока при амперметрическом титровании цит. Р-450 3 А 4 (CYP 3 А 4) тестостероном при контролируемом напряжении Е = -0, 5 В (vs. Ag/Ag. Cl). На вставке – рассчет элктрохимической Км [тестостерон]. (В. В. Шумянцева и соав. , 2015)

Разработка биосенсоров на основе электрохимических цитохром Р 450 -содержащих систем позволяет выявлять субстраты (ксенобиотики), исследовать эффекты лекарственных препаратов на каталитическую активность конкретных изоформ цитохрома Р 450. Цель – создание сенсорных устройств, пригодных для использования в персонифицированной медицине, проведения экспериментов по изучению влияния лекарственных препаратов на активность СYР в системах электрод/цитохром Р 450.

Преимущества электрохимического метода исследования цитохром Р 450 -монооксигеназной системы 1) электрохимическая система не требует использования дорогостоящих и неустойчивых восстановительных эквивалентов NADPH и NADH, т. к. применяется альтернативный источник электронов – электрод; 2) не требует полного реконструирования монооксигеназной системы (использования всех компонентов микросомальной системы и белков редокс-партнеров каталитического цикла цитохрома Р 450); 3) метод обладает высокой чувствительностью и позволяет использовать минимальное количество дорогостоящего фермента (до 10 -12 мкмоль белка/электрод); 4) электрокатализ и контролируемость ферментативного процесса с помощью электрического тока обладает высокой эффективностью; 5) можно предотвращать инактивацию интактных изоформ Р 450 путем использования различных синтетических модификаторов поверхности электрода.

Методы оценки состояния системы биотранс- формации ксенобиотиков: 1) Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Дает возможность исследовать аналиты в моче, крови, слюне, другом биологическом материале после введения ксенобиотика (лекарственного вещества). Можно проводить кинетический анализ, позволяющий определить период полувыведения тестового препарата, объем кажущегося распределения, клиренс элиминации, исследовать другие параметры. Аналит – это компонент или характеристика образца, подлежащий (ая) измерению. Это понятие включает в себя любой элемент: ион, соединение, вещество, фактор, инфекционный агент, клетку, органеллу, активность (ферментативную, гормональную, иммунологическую) или признак: наличие или отсутствие, концентрацию, активность, интенсивность или другие характеристики, которые необходимо определить. Понятие сформулировано Национальным комитетом по клиническим лабораторным стандартам США (NCCLS, document NRSCL 8 -A). Близко к употребляемому у нас термину «лабораторный показатель» , «параметр» , «тест» и др.

2) ПЦР-ПДРФ анализ полиморфизма и мутантных форм генов цит. Р-450. W; Результаты анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ) гена CYP 1 A 2: 1 – маркер молекулярных масс; 2, 4, 6, 7, 8, 10 и 11 – мутантный генотип – M (мутация в сайте рестрикции – рестрикция не происходит); 3 – мутация отсутствует – генотип дикого типа – 5 и 9 – гетерозиготный генотип – имеются все фрагменты – H; 12 – отрицательный контроль.

3) ДНК-чипы Позволяют одновременно определять очень большое количество полиморфизмов в одной пробе. На твердом чипе очень небольшого размера в виде отдельных пятен размещается большое количество олигонуклеотидных зондов, каждый из которых обеспечивает специфическую гибридизацию с нормальными и мутантными аллелями множества различных генов. Перед проведением гибридизации проводят неспецифическое флуоресцентное мечение исследуемой ДНК. В случае связывания ДНК образца с зондом на чипе выявляется флуоресцентный сигнал соответствующего участка чипа [Иванов, Терешин, Щербак, 2010]. Зная, какая аллель отвечает за синтез того или иного изофермента цит. Р-450, можно определить какие ксенобиотики и каким путем будут биотрансформированы.

4) Компьютерные программы для моделирования взаимодействия лигандов с цитохромами Р 450 Для изучения взаимодействия субстрата и фермента используются методы молекулярного докинга и молекулярной динамики. Молекулярный докинг (или молекулярная стыковка) - это метод молекулярного моделирования, который позволяет предсказать наиболее выгодную для образования устойчивого комплекса ориентацию и положение одной молекулы по отношению к другой. При помощи скоринговых функций (англ. score - счет), определяют наиболее энергетически выгодные конформации лиганда в активном центре. Молекулярная динамика - метод, в котором временная эволюция системы взаимодействующих атомов или частиц отслеживается интегрированием их уравнений движения. Играет важную роль (наряду с кристаллографией и ЯМР) в определении структуры белка и уточнении его свойств. Наиболее популярными пакетами программного обеспечения для моделирования динамики биологических молекул являются: AMBER, CHARMM (и коммерческая версия CHARMMm), GROMACS, GROMOS, Lammhs, HOOMD-blue, NAMD.

При описании взаимодействия цит. Р-450 и лигандов оценивается роль пространственных и энергетических факторов, т. к. вклад этих факторов для различных цит. Р 450 отличается. Для исчерпывающего описания взаимодействия низкомолекулярного лиганда и цит. Р-450 in silico и предсказания возможных биотрансформаций необходимо учитывать: § реакционную способность фермента, § структуру активного центра фермента, § расположение и конформацию лиганда в активном центре фермента, § возможность множественных способов связывания субстрата в активном центре фермента (связывание может происходить опосредованно через молекулы воды), § региоспецифичную реакционную способность, присущую самому субстрату (она может меняться в зависимости от конформации, принимаемой субстратом), § аффинность продукта, который должен высвободиться из активного центра фермента.

Р-ция наз. региоспецифичной, если в качестве единств. продукта (в пределах ошибки) образуется один из двух или нескольких возможных регио-изомеров. Региоизомеры – это изомеры, образующиеся в результате преобразования одного из нескольких возможных реакционных центров, имеющихся в молекуле субстрата. Если один изомер лишь преобладает в продуктах р -ции, такая р-ция наз. региоселективной. Напр. , присоединение несимметричного электрофильного НВг к несимметричному стиролу С 6 Н 5 СН=СН 2 происходит региоспецифично: образуется только один из двух возможных продуктов присоединения – С 6 Н 5 СНВr. СН 3, но не С 6 Н 5 СН 2 Вr.

QSAR модели. Количественные взаимоотношения структура-активность (QSAR - англ. сокр. от Quantitative Structure-Activity Relationships) позволяют по описанию структуры химических соединений предсказывать их свойства, в том числе устанавливать взаимодействие с цитохромами низкомолекулярных соединений и их биотрансформацию. Например: 1) для классификации субстратов различных цитохромов применяются: метод построения опорных векторов, метод К-ближайших соседей, метод дерева принятия решений и др. 2) для оценки взаимодействия лигандов, (субстратов и ингибиторов) с активным центром цитохрома используются трехмерные QSAR (3 -D QSAR) методы.

Суперсемейство цит. Р-450 катализирует большое количество реакций, проходящих по разным механизмам, поэтому классические QSAR методы не могут быть применены корректно для веществ, принадлежащих к различным классам. Для каждого отдельного цитохрома, метаболизирующего ксенобиотик, нужно строить специальную QSAR модель с использованием различных дескрипторов и разных математических методов.

Основные цитохромы Р 450, ответственные за метаболизм лекарств в организме человека исследуемые in silico – это подсемейство цит. Р-450 3 А. Цитохром Р 450 ЗА 4 является мембраносвязанным белком, расположен в эндоплазматическом ретикулуме. Молекулярная масса 57299 D, в первичной структуре содержится 502 аминокислотных остатка. Ген CYP 3 A 4 расположен в длинном плече седьмой хромосомы (7 q 22. 1). Подсемейство ЗА – наиболее экспрессируемое в печени и кишечнике. Примерно 2/3 цитохромов печени принадлежат к этому подсемейству. Два цит. Р 450 ЗА 4 и 3 А 5 подробно описаны в литературе. Цит. Р 450 ЗА 5 чаще встречается у подростков, полиморфно экспрессируемый и не индуцируемый глюкокортикоидами, в отличие от ЗА 4. Существует еще одна эмбрионально экспрессируемая изоформа - ЗА 7 (составляет 50 % фетальных цитохромов Р 450).

Цитохром b 5 – гемопротеин, участвует в разнообразных биохимических окислительно-восстановительных реакциях в качестве переносчика электронов. Молекула микросомального цитохрома b 5 состоит из двух доменов - гидрофильного и гидрофобного. Гидрофильный N-концевой участок расположен на поверхности мембраны ЭР, образован аминокислотными остатками с 1 -88, содержит гем, входящий в состав активного центра. Схематичное изображение расположения молекулы цитохрома b 5 в мембране.

Гидрофобный домен цитохрома b 5 заякорен в липидном бислое (ЭПР или митохондриальной), спирализован, образован остатками аминокислот C- конца белковой молекулы (остатки аминокислот 89 -133). С помощью компьютерного моделирования показано, что С -концевой участок молекулы цитохрома b 5 образует петлю и пронизывает липидную мембрану насквозь. Наибольшая гидрофобность наблюдается в средней части петли, которая погружена в мембрану. С-концевая часть молекулы фермента играет важную роль при встраивании в мембрану, ориентации энзима в липидном бислое, обеспечении функциональной активности.

Цитохром b 5 наружной мембраны митохондриий, по сравнению с микросомальным обладает более низким редокспотенциалом, молекула более устойчива к химической и термической денатурации, связь между апопротеином и гемом значительно прочнее. В молекуле цитохрома b 5 митохондрий выявлено два гидрофобных участка. Первый формируют остатки аланина-18, изолейцина-32, лейцина-36 и лейцина-47. Второй – изолейцин 25, фенилаланин-58, лейцин-71 и гем. С использованием мутантных форм молекулы показано, что оба гидрофобных участка имеют большое значение в поддержании стабильности молекулы. При отсутствии или замены в них аминокислотных остатков взаимодействие апопротеина с гемом снижается.

Роль цитохрома b 5 в реакциях, катализируемых изоформами системы цитохрома Р-450. Возможные механизмы стимулирующего влияния цит. b 5 на изоформы цит. Р-450: прямая передача электрона в монооксигеназной реакции, без посредства НАДФ цитохром Р-450 редуктазы; в случае использования второго электрона от цитохрома b 5 в монооксигеназном цикле происходит образование более активных радикалов кислорода, что, в свою очередь, сопровождается более быстрым образованием метаболита;

цит. b 5 взаимодействует с цит. Р-450 с образованием комплекса двух гемопротеинов и последующей передачей двух электронов от НАДФН цитохром Р-450 редуктазы. Это повышает скорость образования активного кислорода и устраняет необходимость повторного взаимодействия цит. Р-450 и НАДФН цитохром Р-450 редуктазы; цит. b 5 может осуществлять аллостерическую стимуляцию цит. Р- 450 без переноса электронов, например на втором этапе каталического цикла; цитохром b 5 может оказывать защитное действие на молекулы терминальной оксигеназы, которое не связано с реакциями окислительно-восстановительного цикла, что предотвращет ее разрушение.

Влияние цит. b 5 на изменение скорости реакции, спектра метаболитов и образование активных форм кислорода в реакциях системы цит. Р-450. в присутствии цит. b 5 скорость метаболизма большинства эндогенных соединений и ксенобиотиков чаще всего повышается; влияние цит. b 5 на биотрансформацию одного и того же соединения, например андростендиона, у разных видов животных неодинаково. У кроликов в присутствии цит b 5 скорость метаболизма стероида цит. Р-450 2 В 5 повышается, а у собак – цит. Р-450 2 В 11 снижается;

цит. b 5 у разных видов (человек и хомячок) может не изменять скорости окисления соединения (нитрозамин) или оказывать стимулирующее действие; наличие цит. b 5 изменяет спектр метаболитов, образующихся при биотринсформации соединения одной и той же изоформой цит. Р-450, например тетрахлорбифенила цит. Р-450 2 В 1; в присутствии цит. b 5 уменьшается образование активных форм кислорода, гиперпродукция которых оказывает негативное действие на жизнедеятельность клеток организма; метаболизм биологически активных соединений (арахидоновая кислота, лейкотриены) происходит только в присутствии цит. b 5.

Влияние цитохрома b 5 на изменение скорости реакции, спектра метаболитов и образование активных форм кислорода в реакциях при участии различных изоформ цит. Р-450 (фрагмент) Изоформа цитохрома Р-450 Субстрат Изменение скорости реакции Р-450 1 А 1 тетрахлорбифенил П Р-450 2 А 1 Р-450 2 В 1 Андростендион П - II - П Р-450 2 В 2 2 -хлор-1, 1 дифлуороэтина тетрахлорбифенил (2, 2", 5, 5"- и 2, 3", 4", 5 -) тетрахлорбифенил (2, 3, 4, 4 -) 9 -антралдегид Р-450 2 В 4 Тетранитрометан Н - II - Aминопирин П Андростендион П Тестостерон не изменяет Образование активных форм кислорода ↓ метанол, 7 -этоксикумарин 9 -антралдегид Изменение спектра метаболитов Р-450 1 А 2 - II - Р-450 2 В 5 - II - ↓ П П изменяется ↓ изменяется П изменяется

НАДН-цитохром b 5 -редуктаза – флавопротеин. Это двухдоменный белок, глобулярный цитозольный домен связывает ФАД, гидрофобный домен (единственный «хвост») закрепляет белок в мембране.

Нашу жизнь невозможно представить без лекарств. Стоит заболеть голове или заколоть в боку-мы тут же хватаемся за наш любимый цитрамон или дротаверин. Очень редко мы задумываемся о том, что же происходит в нашем организме с препаратами, поступившими внутрь и каким безопасным образом эти лекарства нейтрализуются и выводятся из организма, после того как они выполнили свою основную функцию.

Как показали филогенетические исследования, цитохромы Р- 450 появились в живых организмах более трёх миллиардов лет назад.

Исследованиями структуры и формы цитохромов занимались P. Williams, благодаря её работе была расшифрована структура изоформы 2С5 цитохрома Р450 у кролика. В компания «Astex» она в дальнейшем продолжила свою работу по исследованию цитохромов, но уже человека. В 2001 году была расшифрована структура цит 2С9 человека. А также компания «Astex» представила информацию о структуре цит 3А4, который метаболизирует очень многие лекарственные препараты, применяемые повсеместно.

Итак, основным органом, который превращает липофильные лекарственные препараты в гидрофильный метаболит, является печень. Препарат попадает в гепатоцит путем активного либо пассивного транспорта, где под влиянием ферментов-цитохрома Р450 он проходит ряд превращений. . Процесс метаболизма протекает в 2 фазы. В первую фазу основную роль играет МСГ(цитохром Р450), лекарственный препарат вступает в реакции окисления, гидроксилирования, гидролиза а также восстановления. Все те ферменты, которые относятся к семейству цитР450, являются монооксигеназами, которые в качестве кофермента содержат железосодержащий гем. Группа гема переводит кислород в активную форму. Вначале атом железа Fe³+, далее цитохром начинает связывать субстрат, расположенный рядом с гемом. В свою очередь, трехвалентное железо восстанавливается до двухвалентного и присоединяет молекулу кислорода. Электроны с НАДФН Н+ переносятся, атом железа окисляется, восстановленный атом Fe восстанавливает связанный кислород в пероксид. От промежуточного продукта отщепляется ион гидроксила, образуется молекула воды и реакционноспособный кислород. Атом кислорода, став активным, атакует связь С-Н субстрата и образуется гидроксигруппа. Когда продукт реакции освобождается, фермент возвращается в свое исходное состояние. НАДН Н+ участвует в реакции в качестве восстановителя.

RH (субстрат)+ О2+НАДН Н+ -> ROH(продукт)+Н2О+НАДФ+ .

Рис. 1. Этапы гидроксилирования субстрата цитохромом Р450.

Как уже было упомянуто выше, цитохром Р450 участвует в реакциях гидроксилирования алифатического или ароматического атома углерода, перенос окисленной группы, изомеризации, N-гидроксилидегалогенирование, эпоксидирование двойной связи, оксигенирование гетероатомов (S-, N-), разрушение двойной связи и так далее. Допустим, в качестве примера можно привести гидроксилирование анилина и его превращение в n-аминофенол.

Цитохромы Р450 являются семейством изоформ. Определенная изоформа кодируется отдельным геном. К настоящему времени у человека известно 25 цитР450. Они распространены в клетках органов и тканей. Наибольшая концентрация цитР450 обнаруживается в клетках печени-гепатоцитах. .

Некоторые лекарственные препараты способны индуктировать работу цитохромов Р450, тем самым ускоряется детоксикация, и метаболиты быстрее выводятся из организма. Например, к ним относится фенолбарбитурат. Его длительное применение в качестве снотворного усиливает метаболизм и постепенно уменьшается время сна.

Эти лекарственные препараты активируют транскрипцию генов цитохромов, их вырабатывается большее количество, и они лучше утилизируют метаболиты.

Кроме того, на индукцию цитохромов Р450 влияют не только лекарственные препараты, но и стресс, а также определенные физические воздействия.

Индукция цитохрома Р450 может иметь и негативные последствия, так как может служить причиной взаимодействия лекарственных препаратов между собой. Допустим, принятие лекарственного препарата и сока грейпфрута может вызвать побочное действие и снизить эффективность средства.

Также индукция цитохрома одним препаратом может оказывать влияние на метаболизм другого препарата. В качестве примера можно привести снижение уровня препарата в крови из-за воздействия зверобоя дырчатого. Это может значительно ухудшить состояние больного.

Для предотвращения нежелательных последствий необходимо знание индукторов и ингибиторов изоформ цитР450.

К сожалению, существуют генетические нарушения и дефекты генов, отвечающих за выработку различных изоформ цитохрома Р450 и вызывают их полиформизм.

Были проведены исследования антиаритмического лекарственного средства спартеина, в ходе которых было выявлено, что у части испытуемых проявляются побочные действия, такие как фотопсия, двоение в глазах, головная боль и нарушения аккомодации. Оказывается, что спартеин не подвергался метаболизму у некоторых испытуемых из-за дефекта цитР2D6.

Существуют два пути обезвреживания метаболитов в печени.

1. Гепатотоксичное лекарство при нарушении процессов детоксикации приводит в развитию гепатотоксочности.
2. Безвредное лекарство метаболизируется цитР450 в реактивный либо потенциально токсичный метаболит.

Примером может служить относительно безвредный парацетамол. Слишком большая принятая доза может послужить развитием центролобулярных некрозов и печеночной недостаточности.

Значение цитохрома Р450 невозможно переоценить. Именно благодаря этой системе ферментов печень выполняет свою важную функцию-детоксикационную. Благодаря этому все те лекарственные препараты, которые мы принимаем, успешно метаболизируются и выводится из организма.

Недостаток ферментов семейства цитР450 ведет к тяжелым и часто необратимым последствиям.

Список литературы:

1. Райс Р.Х., Гуляева Л.Ф., Биологические эффекты токсических соединений: Курс лекций/Новосибирский гос. университет. Новосибирск, 2003. – 208 с.
2. Таганович А.Д. Патологическая биохимия /Таганович А.Д.,Олецкий Э.И., Котович И.Л./Под общей редакцией Тагановича А.Д. – М.: Издательство БИНОМ. 2013 – 448с.:ил.
3. Roeder M.W/ Cytochrome P450 enzymes and genotype-guided drug therapy// Cur Mol. Ther. 2009 – Vol.11, N 1:P.1 632-40.

Микросомальное окисление – это последовательность реакций с участием оксигеназ и НАДФН , приводящих к внедрению атома кислорода в состав неполярной молекулы и появлению у нее гидрофильности и повышает ее реакционную способность..

Реакции микросомального окисления осуществляются несколькими ферментами, расположенными на мембранах эндоплазматического ретикулума (в случае in vitro они называются микросомальные мембраны). Ферменты организуют короткие цепи, которые заканчиваются цитохромом P 450 .

Реакции микросомального окисления относятся к реакциям фазы 1 и предназначены для придания гидрофобной молекуле полярных свойств и/или для повышения ее гидрофильности, усиления реакционной способности молекул для участия в реакциях 2 фазы. В реакциях окисления происходит образование или высвобождение гидроксильных, карбоксильных, тиоловых и аминогрупп, которые и являются гидрофильными.

Ферменты микросомального окисления располагаются в гладком эндоплазматическом ретикулуме и являются оксидазами со смешанной функцией (монооксигеназами).

Цитохром P450

Основным белком микросомального окисления является гемопротеин – цитохром Р 450 . В природе существует до 150 изоформ этого белка, окисляющих около 3000 различных субстратов. Соотношение разных изоформ цитохрома Р450 различается в силу генетических особенностей. Считается, что одни изоформы участвуют в биотрансформации ксенобиотиков, другие – метаболизируют эндогенные соединения (стероидные гормоны, простагландины, жирные кислоты и др.).

Цитохром Р450 взаимодействует с молекулярным кислородом и включает один атом кислорода в молекулу субстрата, способствуя появлению (усилению) у нее гидрофильности, а другой – в молекулу воды. Основными его реакциями являются:

• окислительное деалкилирование, сопровождающееся окислением алкильной группы (при атомах N, O или S) до альдегидной и ее отщеплением,
• окисление (гидроксилирование) неполярных соединений с алифатическими или ароматическими кольцами,
• окисление спиртов до соответствующих альдегидов.

Работа цитохрома Р 450 обеспечивается двумя ферментами:

• НАДН‑цитохром b 5 ‑оксидоредуктаза , содержит ФАД ,
• НАДФН‑цитохром Р 450 ‑оксидоредуктаза , содержит ФМН и ФАД .

Схема взаиморасположения ферментов микросомального окисления и их функции

Обе оксидоредуктазы получают электроны от соответствующих восстановленных эквивалентов и передают их на цитохром Р 450 . Этот белок, предварительно присоединив молекулу восстановленного субстрата, связывается с молекулой кислорода. Получив еще один электрон, цитохром P 450 осуществляет включение в состав гидрофобного субстрата первого атома кислорода (окисление субстрата). Одновременно происходит восстановление второго атома кислорода до воды.

Последовательность реакций гидроксилирования субстратов с участием цитохрома Р450

Существенной особенностью микросомального окисления является способность к индукции или ингибированию, т.е. к изменению мощности процесса.

Индукторами являются вещества, активирующие синтез цитохрома Р 450 и транскрипцию соответствующих мРНК. Они бывают

1. Широкого спектра действия, которые обладают способностью стимулировать синтез цитохрома Р 450 , НАДФН-цитохром Р 450 -оксидоредуктазы и глюкуронилтрансферазы. Классическим представителем являются производные барбитуровой кислоты – барбитураты, также в эту группу входят диазепам , карбамазепин , рифампицин и др.

2. Узкого спектр а действия, т.е. стимулируют одну из форм цитохрома Р 450 – ароматические полициклические углеводороды (метилхолантрен , спиронолактон ), этанол.

Например, этанол стимулирует синтез изоформы Р 450 2Е1 (алкогольоксидаза) которая участвует в метаболизме, этанола, нитрозаминов, парацетамола и др.
Глюкокортикоиды индуцируют изоформу Р 450 3А.

Ингибиторы микросомального окисления связываются с белковой частью цитохрома или с железом гема. Они делятся на:

1. Обратимые

• прямого действия – угарный газ (СО ), антиоксиданты ,
• непрямого действия , т.е. влияют через промежуточные продукты своего метаболизма, которые образуют комплексы с цитохромом Р 450 – эритромицин .

2. Необратимые ингибиторы – аллопуринол , аминазин , прогестерон , оральные контрацептивы , тетурам , фторурацил ,

Оценка реакций 1-й фазы

Оценку микросомального окисления можно проводить следующими способами:

• определение активности микросомальных ферментов после биопсии,
• по фармакокинетике препаратов,
• с помощью метаболических маркеров (антипириновая проба ).

Антипириновая проба

Обследуемый принимает утром натощак амидопирин из расчета 6 мг/кг веса. Собирается 4 порции мочи в интервале соответственно от 1 до 6 часов, 6-12, 12-24 и 45-48 часов. Объем мочи измеряется. Не позже, чем через 24 часа моча центрифугируется или фильтруется. Далее исследуется концентрация 4-аминоантипирина и его метаболита N-ацетил-4-аминоантипирина в моче.